1670-ih, Antonie van Leeuwenhoek koristio je svjetlosni mikroskop za povećanje sićušnih živih objekata i, u tom procesu, otkrio cijeli svijet nevidljiv golim okom. Njegova mnoga opažanja uključivala su bakterije koje se brzo kreću, protozoe s repovima i crvena krvna zrnca koja jure kroz kapilare.

Tijekom stoljeća koja su slijedila, svjetlosni mikroskopi postali su moćniji i vidjeli su manje stvari - ali njihova snaga je imala granicu. Prema zakonima fizike, minimalna razlučivost za optičku mikroskopiju je otprilike polovica valne duljine svjetlosti, bez obzira na objektiv ili dizajn otvora blende. Abbeova granica difrakcije, nazvana po fizičaru Ernstu Abbeu, koji ju je prvi opisao 1873., navela je znanstvenike na uvjerenje da će finiji detalji stanica, zajedno s virusima i proteinima, uvijek izgledati zbrkano.

Više od 120 godina kasnije, programeri optičke mikroskopije super-razlučivosti pametno su zaobišli Abbeovu granicu difrakcije - i dobili Nobelovu nagradu za kemiju 2014. za svoj herkulovski podvig. Do ovog trenutka, mikroskopi super-razlučivosti snimali su samo 2D slike gornjih slojeva biološkog tkiva. Sada je tim istraživača napravio korak dalje snimivši prve 3D slike super-razlučivosti duboko u mozgu živog miša.

"Sinapse koje povezuju jedan neuron s drugim široke su nekoliko stotina nanometara i ne možete ih razlučiti u normalnom svjetlosnom mikroskopu. Razlučivost tradicionalne svjetlosne mikroskopije ograničena je na oko 250 nanometara, što je na biološkoj skali prilično veliko “, rekao je biofizičar i voditelj istraživačkog tima Joerg Bewersdorf na Yale School of Medicine. "S mikroskopom super-razlučivosti možete se spustiti na manje od 100 ili čak 10 nanometara."

Studija, objavljena u časopisu Optica, pokazuje moć ove nove vrste mikroskopa za vizualizaciju detalja ispod površine živog mozga i drugih organa. Dok elektronski mikroskopi mogu promatrati mnogo manje objekte od čak mikroskopa super-razlučivosti, visoka energija snopa elektrona uništila bi funkcionalno biološko tkivo.

"Slike u cjelini, netaknute, žive - a kasnije i učenje i ponašanje - miš je apsolutno potreban za posljednji korak u razumijevanju funkcije mozga", rekla je Katrin Willig s Instituta za eksperimentalnu medicinu Max Planck, koja nije bila uključena u studiju. "Pogotovo učenje i pamćenje mogu se razumjeti samo u funkcionalnom mozgu, a moždane kriške ili kultivirane stanice nisu adekvatna zamjena."

Bewersdorf i njegova bivša studentica diplomskog studija, Mary Grace M. Velasco, proveli su više od pet godina radeći na mikroskopu, koji kombinira nekoliko tehničkih napretka za prevladavanje poteškoća 3D snimanja. Počeli su s mikroskopom stimuliranog iscrpljivanja emisije (eng. Stimulated Emission Depletion ili STED), postojećom tehnikom super-razlučivosti koja koristi skenirane svjetlosne impulse i fluorescentne molekule kako bi izložila maleni dio uzorka u isto vrijeme. Dopuštajući samo dijelu veličine nanometra da fluorescira i registrira, STED mikroskopija može zaobići granicu Abbeove difrakcije.

Međutim, biološko tkivo snažno raspršuje svjetlost, što znači da laserska zraka ima problema da dosegne dubine veće od nekoliko desetaka nanometara. Dakle, istraživači su kombinirali STED mikroskopiju s drugom tehnikom koja se temelji na svjetlu, nazvanom dvofotonska ekscitacijska (eng. Two-photon Excitation ili 2PE) mikroskopija.

"2PE omogućuje snimanje dublje u tkivu korištenjem bliskih infracrvenih valnih duljina umjesto vidljive svjetlosti", rekao je Velasco. "Infracrveno svjetlo je manje osjetljivo na raspršivanje i, stoga, bolje može prodrijeti duboko u tkivo."

Velasco i njezini kolege također su primijenili tehnologiju adaptivne optike - istu tehnologiju koja se koristi u astronomiji za ispravljanje atmosferskih izobličenja pri promatranju zvijezda - kako bi kompenzirali složena izobličenja svjetlosti zbog neravnina moždanog tkiva. Na kraju, odabrali su posebnu leću objektiva i crvenu fluorescentnu boju koji su bili prikladniji za snimanje dubokih tkiva.

Kada se testira, njihov 3D-2PE-STED sustav mogao je razabrati 3D strukturu dendritskih bodlji, malih izbočina na granama neurona koji primaju sinaptičke ulaze od susjednih neurona. Ispitivao je dendritične bodlje do 76 mikrona ispod površine mozga i uočio suptilne svakodnevne promjene koje je teško razlikovati samo pomoću 2PE mikroskopije.

"Znamo da kada mozak nešto nauči, njegova se struktura zapravo mijenja. Nove sinapse nastaju ili postaju jače, dok druge nestaju ili postaju slabije. Potreban vam je mikroskop koji ima rezoluciju da razriješi te sinapse tako da možete vidjeti kako se oblik mijenja, “, rekao je Bewersdorf. "Ako želite razumjeti kako učenje funkcionira, onda ovaj mikroskop postaje vrlo koristan jer nam omogućuje da u suštini promatramo životinju dok uči."

Vanjski stručnjaci na području STED mikroskopije vjeruju da ovaj rad predstavlja važan napredak za primjenu u biomedicinskim istraživanjima - ali uz neka upozorenja.

Valentin Nägerl, neuroznanstvenik i istraživač STED-a na Sveučilištu Bordeaux u Francuskoj, ohrabren je korištenjem adaptivne optike od strane istraživača kako bi spasili kvalitetu podataka iz dubljeg mozga miša, gdje je prisutna zanimljivija neuronska aktivnost. No, dok sustav utire put prema postizanju prave 3D slike super-razlučivosti, on vjeruje da još uvijek ne ispunjava cilj.

"Iako sam potpuno pretplaćen na njihovu tehnologiju, nisam toliko impresioniran slikama, [koje ostavljaju] prostora za poboljšanje", rekao je Nägerl. "Kao što autori ističu, učinci poput raspršenja i pokreta mozga u slučaju živih životinja i dalje predstavljaju velike izazove koji sprječavaju ili potkopavaju STED snimanje."

Ilaria Testa, biofizičarka na KTH Royal Institute of Technology u Švedskoj koja nije bila uključena u istraživanje, vjeruje da bi tehnika mogla imati široku primjenjivost. "Ova metoda otvara put brojnim novim primjenama u fiziološki relevantnim uzorcima", rekla je. "Ne samo moždana tkiva, već i drugi organi kao što su jetra, bubrezi ili srčana tkiva koja su također vrlo raštrkana mogu se proučavati ovim novim sustavom."